WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

«АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНЫХ РНК, СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ БОЛЕЗНЕЙ МОЗГА Методическое пособие к практикуму Генетика поведения когнитивных способностей. Норма и патология Москва, 2012 УДК ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение

"Научный Центр Психического Здоровья" РАМН

АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНЫХ РНК,

СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ БОЛЕЗНЕЙ МОЗГА

Методическое пособие к практикуму

«Генетика поведения когнитивных способностей.

Норма и патология»

Москва, 2012 УДК 577.215;616.89 ББК 28.04 А-64 Андреева Т.В., Кунижева С.С. Анализ регуляторных РНК, связанных с развитием мозга. Методическое пособие к практикуму «Генетика поведения когнитивных способностей. Норма и патология».

Под редакцией доктора биологических наук, профессора Е.И. Рогаева ISBN 978-5-91587-065- В книге изложены теоретические и практические аспекты исследования регуляторных микроРНК. Подробно рассмотрены генетические методы анализа генов, кодирующих микроРНК. Приведена подробная методика выделения и анализа РНК, в том числе с использованием новейшего оборудования.

Издание будет полезным для преподавателей ВУЗов, студентов, аспирантов, стажеров научно-образовательных центров, а также широкого круга специалистов, работающих в области генетических исследований.

В Методическое пособие включены материалы, полученные в рамках проекта «Гены и транскрипция при болезни Альцгеймера», финансируемого Министерством образовании и науки по Программе "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (Госконтракт № 02.740.11.0854 от 28 июня 2010 г.) Андреева Т.В., Кунижева С.С., Москва: Цифровичок. - 2012 г. - 42 с.

Научное издание Андреева Татьяна Владимировна, Кунижева Светлана Станиславовна Анализ регуляторных РНК, связанных с развитием мозга.

(Отпечатано с готового оригинал-макета) ИОГен РАН, ISBN 978-5-91587-065- ФГБУ «НЦПЗ» РАМН,

ОГЛАВЛЕНИЕ

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Общие сведения о регуляторных РНК

МикроРНК в норме и при нейропсихических заболеваниях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Раздел 1. Базовые методы исследования микроРНК и их роли в развитии патологий человека. Анализ полиморфизмов в генах и хромосомных локусах с помощью ПЦР.

Задача 1. Определение аллельного полиморфизма на примере хромосомного локуса человека, содержащем ген MIR9-2

Задача 2. Определение аллельного полиморфизма на примере хромосомного локуса человека, содержащем ген СR1

Задача 3. Определение аллельного полиморфизма на примере хромосомного локуса человека, содержащем ген APOE

Задача 4. Анализ ассоциации полиморфизмов в локусах, кодирующих микро-РНК или в генах-мишенях микро-РНК

Задача 5 (факультативная). Сравнительный анализ частот встречаемости генотипов и аллелей в исследованных выборках с данными, представленными в литературе

Раздел 2. Исследование РНК Задача 6. Выделение РНК из образцов тканей животных

Задача 7. Оценка качественных и количественных характеристик РНК.......... Задача 8. (факультативная) Оценка количества и качества РНК с помощью биоанализатора Agilent.2100.Bioanalyzer

Задача 9. Синтез первой цепи кДНК

Задача 10. Проведение ПЦР с использованием в качестве матрицы синтезированной кДНК

ЛИТЕРАТУРА

ПРИЛОЖЕНИЕ

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Одним из результатов реализации проекта по секвенированию генома человека стало выявление того факта, что число генов, кодирующих белки у человека, значительно меньше ( 24000-30000), чем ожидалось (100000). Более того, число таких генов не отражает сложность организма, поскольку число генов у сравнительно простого беспозвоночного почвенного червя Сaenorhabditis еlegans больше, чем у Drosophila melanogaster, и близко к числу генов у человека. Известно, что большая часть генома человека (90-95%) представлена некодирующими последовательностями ДНК. Детальные исследования транскрипционной активности генома показали, что значительная доля некодирующих геномных последовательностей транскрибируется, то есть происходит образование РНК с возможными регуляторными функциями, многие из которых ещё не охарактеризованы. Наиболее активно исследуемым в настоящее время классом таких РНК являются микроРНК.

МикроРНК представляют собой класс небольших регуляторных РНК, контролирующих уровень транскриптов или белковых продуктов в клетке. Зрелые микроРНК представляют собой молекулы ~19-24 п.н., образуемые из более длинных РНК-предшественников (~70-100 п.н.) и имеющих специфическую шпилечную структуру (рис. 1). МикроРНК формируют несовершенный дуплекс с 3'-UTR участками мРНК в составе комплекса RISC, что приводит к подавлению трансляции или деградации мРНК-мишени (Рогаев и др., 2008). МикроРНК могут формировать гетеродуплексы не только с 3'-UTR участками мРНК, но также с кодирующими участками, а также с 5’-UTR (Orom et al., 2008;

Tay et al., 2008).

Рис. 1. Схема основного пути образования микроРНК Некодирующие РНК млекопитающих выполняют множество функций, участвуя в процессинге и трансляции РНК, модификации тканеспецифичного редактирования РНК, в работе сплайсосомы, теломеразного комплекса, в компенсации дозы генов X-хромосомы, регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции и трансляции, в геномном импринтинге и других важных клеточных процессах.



Прежние представления о незначимости функций белок-некодирующих РНК стали меняться относительно недавно. Было показано, что ряд некодирующих РНК (помимо рРНК, тРНК и сплайсосомных РНК) продолжительность их жизни в клетке сравнима с продолжительностью жизни мРНК. Учитывая результаты недавних исследований, свидетельствующих о том, что большая часть генома может транскрибироваться и более 90% геномных последовательностей представлены в первичных транскриптах различных тканей (как это показано в проекте ENCODE при анализе участков, покрывающих 1% всего генома человека (The ENCODE Project Consortium), необходимо признать, что функции некодирующих РНК могут оказаться намного более значимыми, чем это представлялось ранее.

МикроРНК в норме и при нейропсихических заболеваниях экспрессии не менее 9%-30% белок-кодирующих генов генома человека. При этом, как правило, для каждой микроРНК можно предсказать множество мишеней, и напротив, многие гены несут потенциальные сайты распознавания для различных микроРНК.

Регуляция экспрессии генов посредством микроРНК отличается высокой скоростью реагирования, обратимостью и возможностью локально изменять уровень мРНК-мишеней и белков в отдельных компартментах клетки, в отличие от регуляции, осуществляемой факторами транскрипции. Это крайне важно, например, для обеспечения синаптической пластичности нейронов.

МикроРНК играет важную роль в развитии нервной системы, функционировании синапсов и синаптической пластичности (см. обзор Kosik and Krichevsky, 2005; Bredy et al., 2011). Показано, что процесс нейрогенеза сопровождается изменением профиля продукции микроРНК. Важное значение микроРНК в клеточной дифференцировке и функционировании различных органов и физиологических систем в норме подразумевает, что сбои в работе микроРНК могут вести к нарушениям развития и болезням.

заболеваний, таких как нарушения развития нервной системы при аутизме и задержке умственного развития, возрастное снижение интеллекта и памяти при деменциях, не полностью прояснена, а в случае шизофрении и депрессии – вовсе не известна. Результаты исследований на модельных животных в сочетании с ныне доступными данными изучения патологий человека, указывают, что профили экспрессии микроРНК может быть важным и часто игнорируемым типом клеточных регуляторов, вовлеченных в функционирование мозга в норме и при патологии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РАЗДЕЛ 1. Базовые методы исследования микроРНК и их роли в развитии патологий человека. Анализ полиморфизмов в генах и хромосомных локусах с помощью ПЦР Задачи данного раздела знакомят с тестированием полиморфных маркеров в геноме человека с использованием нескольких методов:

ПЦР-ПДРФ и аллель-специфической ПЦР.

Для генотипирования используют образцы ДНК человека, подготовленные преподавателем. Процедура анализа включает:

1. Проведение ПЦР 2. Обработку ПЦР-продуктов эндонуклеазами рестрикции 3. Электрофорез полученных продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном гелях.

4. Определение размеров рестрикционных фрагментов и определение генотипов исследуемых локусов.

Проводят анализ генов, потенциально вовлеченных в развитие нервной системы и патогенез болезни Альцгеймера, например:

– Ген APOE расположен на хромосоме 19 и кодирует аполипопротеин Е – белок, играющий важную роль в метаболизме и транспорте липидов, в частности, в поддержании обмена холестерина.

В гене APOE известны две транзиции C T, каждая из которых ведет к замене аргинина на цистеин в полипептидной цепи белка: в положении 112 и 158 полипептидной цепи. Этим полиморфным вариантам гена соответствуют три изоформы белка – Е2 (Cys112, Cys158); Е3 (Cys112, Arg158); Е4 (Arg112, Arg158). Независимыми исследованиями подтверждено, что аллель APOE4 гена APOE у больных с поздней формой БА встречается чаще, чем у людей пожилого возраста без признаков деменций, но в то же время отмечено, что в ряде этнических групп такая ассоциация слабо выражена или вовсе отсутствует (1, 2).

– Ген MIR-9-2 кодирует микроРНК, экспрессирующуюся с высоким уровнем в головном мозге. Регулирует экспрессию ряда ключевых генов, вовлеченных в развитие болезни Альцгеймера, таких как PSEN http://www.targetscan.org).

полногеномного анализа ассоциаций показал высокий уровень значимости ассоциации с развитием болезни Альцгеймера (Lambert et al., 2009).

Задача 1. Определение аллельного полиморфизма в хромосомном локусе человека, содержащем ген MIR9- Цель задачи: определение генотипов образцов ДНК методом двунаправленной аллель-специфической ПЦР.

Определение аллельного полиморфизма в гене MIR9-2 проводят методом двунаправленной аллель-специфичной ПЦР. Двунаправленная ПЦР позволяет получить в процессе амплификации каждого аллеля продукты различной длины, что дает возможность определения генотипа непосредственно после амплификации без дополнительного использования эндонуклеаз рестрикции. Принцип метода состоит в одновременном применении четырех праймеров, два из которых – внешние, расположены как в стандартной ПЦР на некотором аллельспецифичных праймера лежат в противоположных направлениях и заканчиваются на вариабельном нуклеотиде (рис. 2).

Рис. 2. Схема двунаправленной аллель-специфической ПЦР. P и Q пара внешних праймеров, A и B — пара внутренних аллель-специфичных праймеров, имеющих на 3’ конце нуклеотид, комплементарный соответствующему аллельному варианту. Х — вариабельный нуклеотид.

Ниже приводится фрагмент полиморфного локуса гена MIR9-2 с указанием исследуемой однонуклеотидной замены:

ATATGTAGACTTGGGCAGTTCCTTTG[G/T]GAGGCACCTCCCTCTCAAAATTTG

Для проведения аллель-специфичнеской двунаправленной ПЦР используют высокоточную модифицированную Taq-полимеразу с «горячим стартом» (например, SNP-detect полимераза, «ЗАО Евроген»

специфической амплификации фрагментов ДНК.

1. Перед проведением реакции подготовить все необходимые дезоксинуклеотидтрифосфатов, каждый из праймеров, SNPdetectполимеразу. Все реагенты, кроме полимеразы, разморозить при комнатной температуре, перемешать коротким вортексированием, сбросить на центрифуге (1-2 тыс. об/мин в течение 5-10 секунд).

Полимеразу размораживать не надо.



Pages:     || 2 | 3 | 4 |
 

Похожие работы:

«Сведения об учебно-методической и иной документации, разработанной образовательной организацией для обеспечения образовательного процесса по 110201.65 Агрономия № Наименование Наименование учебно-методических, пп дисциплины по учебному методических и иных материалов (автор, место плану издания, год издания, тираж) ГЭС.Ф.1 Иностранный язык 1. Учебно-методический комплекс по дисциплине Иностранный язык Краснодар, 2011 г. 2. Учебно-методическое пособие для студентов биологических и с/х...»

«ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ 1.1. Основные понятия и определения..5 1.2. Классификация отходов..7 Глава 2. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ОБРАЩЕНИЯ С ОТХОДАМИ.12 Глава 3. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К НАКОПЛЕНИЮ ОТХОДОВ НА ТЕРРИТОРИИ ПРЕДПРИЯТИЙ Глава 4. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОРГАНИЗАЦИИ ВРЕМЕННОГО ХРАНЕНИЯ ОТХОДОВ.22 Глава 5. ТРЕБОВАНИЯ ПО ОХРАНЕ ТРУДА И ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ОБРАЩЕНИИ С ОТХОДАМИ..33 Глава 6. ОПАСНОСТЬ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ПОЖАРОВ И ВЗРЫВОВ ПРИ ОБРАЩЕНИИ С...»

«СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ НАУКИ В ОБЛАСТИ ЛЕСНОГО ДЕЛА Методические указания Санкт-Петербург 2008 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ имени С.М. Кирова СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ НАУКИ В ОБЛАСТИ ЛЕСНОГО ДЕЛА Методические указания по самостоятельной работе для подготовки магистров по направлению 250100 Лесное дело Санкт-Петербург 2008 2 Рассмотрены и рекомендованы к изданию методическим...»

«Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации 1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИЙ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ РАБОТЕ С МАТЕРИАЛОМ, СОДЕРЖАЩИМ МИКРООРГАНИЗМЫ I - IV ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ Методические указания МУ 1.3.2569-09 Москва -2009 1. Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки “Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии” Роспотребнадзора (В.И. Покровский, Г.А. Шипулин, И.Н....»

«ПРОГРАММА РАЗВИТИЯ ОРГАНИЗАЦИИ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ КАМЧАТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ВИТУСА БЕРИНГА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНЫХ ГУМАНИТАРНЫХ ПРОБЛЕМ МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЦЕНТР ТРАДИЦИОННЫХ КУЛЬТУР НАРОДОВ КАМЧАТКИ В.Н. ШАРАХМАТОВА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО РАБОТЕ С ТРАДИЦИОННЫМИ ЭКОЛОГИЧЕСКИМИ ЗНАНИЯМИ Петропавловск-Камчатский 2008 20.1 Ш25 Методические рекомендации по работе с традиционными экологическими знаниями / Составитель В.Н. Шарахматова. –...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОУ ВПО МАРИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Ю.А. Александров ОСНОВЫ РАДИАЦИОННОЙ ЭКОЛОГИИ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ Йошкар-Ола, 2007 ББК 40.1 УДК 631.5 А 46 Рецензенты: Т.М. Быченко, канд. биол. наук, доц. Иркутского гос. пед. ун-та; О.Л. Воскресенская, канд. биол. наук, доц. МарГУ; В.Н. Самарцев, канд. биол. наук, проф. МарГУ Рекомендовано к изданию редакционно-издательским советом МарГУ Александров Ю.А. А 46 Основы радиационной экологии: Учебное пособие /Мар. гос....»

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ к лабораторным занятиям занятиям по курсу Основы биотехнологии Для студентов специальностей: Н.04.01.00 – биология; Н.06.01.08 – экология МИНСК 2009 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 1 ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. 5 1.1. ПРОДУКЦИЯ ЭКЗОФЕРМЕНТОВ ФИТОПАТОГЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ ERWINIA 2 МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ. 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ПЛАЗМИДЫ pHPr7 И ТРАНСФОРМАЦИЯ...»

«А. Эргашев, Т. Эргашев Основы экологии Ташкент - 2008 Спонсор Ташкентский областной комитет по охране природы. Авторы выражают свою сердечную благодарность руководству Таш­ кентского областного комитета по охране природы за оказанную помощь в публикации данного учебного пособия путем спонсирования и желают ему огромных успехов в области охраны природы. Э ргаш ев А., Эргашев Т. Основы экологии. А. Эргашев, Т. Эргашев. 2008. 304 стр. В данном учебное пособие последовательно излагается история...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тверской государственный университет Кафедра физической географии и экологии Методические указания к лабораторным работам по дисциплине Геология Для студентов I курса очной формы обучения по направлению 022000.62 Экология и природопользование по направлению 021000.62 География Тверь 2012 Составитель доцент А.Г. Жеренков Методические указания предназначены для оказания практической помощи...»

«Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерство здравоохранения Российской Федерации Производственная практика Помощник лаборанта клинических лабораторий ЛПУ, учреждения, осуществляющего деятельность в целях обеспечения Госсанэпиднадзора Методические рекомендации для студентов Волгоград, 2014 г. Рецензенты: зав. кафедрой внутренних болезней педиатрического и стоматологического...»




 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.