WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 13 |

Визуализация и мониторинг активности цитохрома p450 bm3 с использованием атомно-силовой микроскопии

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ

ХИМИИ ИМЕНИ В.Н.ОРЕХОВИЧА»

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

Бухарина Наталья Сергеевна

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И МОНИТОРИНГ АКТИВНОСТИ

ЦИТОХРОМА P450 BM3 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Иванов Москва –

СОДЕРЖАНИЕ

Введение Глава 1. Обзор литературы Цитохром P450 BM 1.1 Энзимология единичных молекул ферментов 1.2 Методы измерения каталитической активности 1.2. единичных молекул ферментов Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных 1.2. молекул ферментов АСМ-визуализация с использованием стандартных и 1. сверхтонких зондов АСМ для исследования активности отдельных 1.3. молекул ферментов Глава 2. Материалы и методы Использованные реактивы и материалы 2.1 Характеристика исследуемого белка 2.2 Методика приготовления образцов для АСМизмерений Методика АСМ-визуализации BM3 с использованием 2. стандартных и сверхтонких зондов Обработка АСМ-изображений 2.4.1 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты 2. единичных молекул BM3 в процессе каталитического цикла фермента Дополнительные методы 2.6 Масс-спектрометрический анализ 2.6.1 Фотонная корреляционная спектроскопия 2.6.2 Методика АСМ-мониторинга температурной 2. денатурации BM3 Флуоресцентный анализ 2.8 Глава 3. Результаты и их обсуждение АСМ-визуализация и определение олигомерного 3. состояния BM3 с использованием стандартных и сверхтонких зондов Исследование олигомерного состояния BM3 методом 3.1. фотонной корреляционной спектроскопии АСМ-визуализация BM3 в жидкости, вакууме и 3.1. воздухе с использованием стандартных зондов АСМ-визуализация BM3 в воздухе и в вакууме с 3.1. использованием сверхтонких зондов Определение олигомерного состояния BM3 из данных 3.1. АСМ-экспериментов Мониторинг активности единичных молекул BM3 c 3. АСМ-измерения колебаний высоты BM3 на разных 3. Флуоресцентный анализ температурной денатурации Обсуждение полученных результатов исследования Благодарности Список используемых сокращений АСМ – атомно-силовой микроскоп, атомно-силовая микроскопия МС – масс-спектрометрия RH – относительная влажность PBSD - фосфатно-солевой буфер Дульбекко FAD – флавинадениндинуклеотид FMN – флавинмононуклеотид ММ – уравнение Михаэлиса-Ментен

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования Изучение единичных молекул ферментов, их физико-химических свойств и активности является одним из приоритетных направлений в биохимии, которое называется энзимологией единичных молекул. Преимущество такого подхода состоит в получении информации о свойствах отдельных биомолекул, а не об усредненных по ансамблю величинах. Например, это позволяет проводить прямой мониторинг стадий (ан)фолдинга белка, наличие которых в стандартных экспериментах лишь предполагается, или наблюдать за работой единичных ферментов на различных стадиях каталитического цикла, характеризовать их промежуточные переходные состояния [1].

Помимо того, что традиционные методы исследования дают возможность получить только усредненные характеристики систем, они обладают также более низкой чувствительностью по сравнению с методами изучения единичных молекул. Это приводит к тому, что в традиционных методах приходится проводить исследования при достаточно высоких концентрациях растворов белков. Использование высоких концентраций растворов приводит к тому, что биомолекулы, склонные к агрегации, находятся в олигомерном состоянии.

Работа же с малыми концентрациями позволяет сместить равновесие в сторону мономерной формы белков и следить за свойствами мономеров и олигомеров.

Также манипуляции с единичными молекулами, в том числе с иммобилизованными единичными молекулами, позволяют напрямую измерять молекулярные силы, структуру и функциональный отклик отдельных молекул на механическое воздействие.

В настоящей работе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) используется для исследования иммобилизованных на подложке отдельных молекул белков в условиях, близких нативным [2], в том числе, для визуализации и изучения физико-химических свойств единичных макромолекул и макромолекулярных комплексов [3]. Субнанометровое вертикальное разрешение этого метода и полуконтактный режим АСМизмерений позволяют с высокой точностью определять высоту белка с минимальным воздействием на него со стороны АСМ-зонда. Таким образом, АСМ можно использовать для визуализации белков, их идентификации по высотам и, соответственно, определения их степени олигомеризации, а также для мониторинга конформационной динамики фермента в процессе осуществления ферментативной реакции. Эти возможности метода АСМ были продемонстрированы в данной работе на примере изучения свойств фермента цитохрома P450 BM3 (BM3), катализирующего монооксигенацию жирных кислот [4]. BM3 принадлежит к суперсемейству гем-содержащих цитохромов P450 и играет важную роль в метаболических путях в организме. Этот белок является самодостаточным ферментом, который не требует наличия дополнительных белков-партнеров для реализации каталитического цикла. В структуре этого фермента редуктазный и гемовый домены объединены в единую полипептидную цепь [5], что обуславливает интерес к нему как к удобной упрощенной модели цитохром P450-содержащих монооксигеназных систем, а также позволило упростить схему измерения активности фермента с помощью АСМ. Ранее было также показано, что полноразмерный BM3 может существовать в мономерной и олигомерной формах, главным образом в виде димерной (50%) [6]. Причем димеры проявляют большую активность, нежели мономеры: kcat =50 s-1 и kcat =10 s-1 для димеров и мономеров, соответственно [7].



Цель работы Цель настоящей работы – визуализация и измерение активности отдельных молекул фермента цитохрома P450 BM3 с использованием АСМ.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Подбор условий нековалентной иммобилизации фермента на АСМподложку для визуализации отдельных молекул.

АСМ-визуализация иммобилизованного фермента в различных средах, определение его олигомерного состояния на основе данных измерений с использованием стандартных и сверхтонких зондов.

Исследование влияния температуры на олигомерное состояние BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа.

АСМ-измерение амплитуды колебаний высоты молекул BM3 на отдельных стадиях каталитического цикла (при добавлении субстрата, донора электронов, ингибитора) при разных температурах и разработка методики определения каталитической активности ферментов из полученных АСМданных.

Научная новизна работы Разработана методика определения олигомерного состояния иммобилизованного фермента BM3 с помощью АСМ c двумя типами зондов:

стандартным и сверхтонким. Исследовано влияние среды АСМ-измерений (жидкость, воздух, вакуум) и типов АСМ-зондов на высоты изображений BM и на его олигомерное состояние. С использованием АСМ-измерений стандартным зондом получено подтверждение, что BM3 в жидкости может находиться как в мономерном, так и в олигомерном состоянии, а с использованием сверхтонкого зонда в вакууме удалось разрешить более детально олигомерное состояние BM3.

Разработана методика определения каталитической активности фермента с помощью АСМ по изменению амплитуды колебаний высоты его отдельных молекул. Показана зависимость амплитуды колебаний высоты отдельных молекул BM3, иммобилизованных на подложке, от температуры с помощью АСМ.

Проведено исследование температурной денатурации цитохрома P450 BM3 методами АСМ и флуоресцентного анализа. Предложен подход для температуры и его температурной денатурацией, который объединяет мониторинг плавления фермента и АСМ-исследование его агрегации в процессе температурной денатурации. В низкотемпературной области 10-33°C с помощью флуоресцентного анализа было обнаружено 3-и кооперативных перехода, а с помощью АСМ-анализа для BM3 продемонстрировано сохранение его глобулярной формы при изменении степени олигомеризации в этой области.

Научно-практическая ценность работы Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора, наиболее интересны следующие полученные результаты: детальное разрешение олигомерного состояния BM3 с помощью сверхтонкой АСМ-иглы, определение особенностей колебаний высоты отдельных молекул фермента BM3, иммобилизованных на подложке, и обнаружение 3-х кооперативных переходов в низкотемпературной области на кривой плавления BM3.

разработанный алгоритм связи каталитической активности единичного фермента и амплитуды колебаний его высоты, полученной из АСМ-данных.

теоретический вклад в развитие методов определения каталитической активности единичных молекул ферментов. Этот подход может быть использован для других ферментативных систем.

Предложен подход совмещения АСМ с флуоресцентным анализом для исследования температурной денатурации ферментов.

Фундаментальные результаты, полученные в диссертационной работе, могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных разработке новых биокаталитических технологий на основе иммобилизованных ферментов для решения задач фармацевтической, пищевой и энергетической промышленности.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих научных конференциях и школах:

«Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» 2010, Москва, Россия;

25th International Symposium on Microscale BioSeparations MSB 2010, Prague, Czech;

бионаноскопии» 2010, Москва, Россия;

состояние и перспективы развития» 2011, Москва, Россия;

17th International Conference on Cytochrome P450 2011, Manchester, European Proteomics Association 2012 Scientific Congress, Glasgow, Scotland.

Личный вклад автора Все экспериментальные АСМ-измерения и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Эксперименты по флуоресцентному к.б.н. Петушковой Н.А.

к.б.н. Кайшевой А.Л. под руководством д.б.н. Згоды В.Г. Эксперименты по электронной микроскопии проведены совместно с Канашенко С.Л. Разработка программного обеспечения для получения траекторий изменения высоты молекул из АСМ-кадров проведена совместно с Крохиным Н.В. Эксперименты по фотонно-корреляционной спектроскопии проведены совместно с к.ф.м.н. Медведевой Н.В.

экспериментальных данных, формулировка теоретических положений выполнены Бухариной Н.С. лично под руководством д.б.н., профессора Иванова Ю.Д.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи, 3 из которых – в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Структура и объем работы Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 101 источник.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ



Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 13 |
 

Похожие материалы:

« Бирюков Сергей Александрович ПАРАМФИСТОМИДОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ХОЗЯЙСТВАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА НЕЧЕРНОЗЕМНОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.11 – паразитология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук научный руководитель – кандидат ветеринарных наук, профессор П.А. Лемехов Москва – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 1. КРАТКАЯ КЛИМАТОГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕВЕРО-ЗАПАДНЫХ ОБЛАСТЕЙ НЕЧЕРНОЗЕМНОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 2. ...»

« Славгородская Дарья Алексеевна ВЛИЯНИЕ СЛОЖНОГО ОРГАНОМИНЕРАЛЬНОГО КОМПОСТА НА СВОЙСТВА ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО И УРОЖАЙНОСТЬ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗАПАДНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ Специальность 03.02.13 – почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Белюченко Иван Степанович Краснодар – 2014 СОДЕРЖАНИЕ С. ВВЕДЕНИЕ 4 1 ОТХОДЫ ПРОМЫШЛЕННОГО И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО 8 ПРОИЗВОДСТВ КАК СЫРЬЕВАЯ ...»

« ТУРЫГИН Сергей Павлович ЦИРКАДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И СПЕЦИАЛЬНОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ ПОДГОТОВЛЕННОСТИ БАСКЕТБОЛИСТОВ В ОБЫЧНЫХ УСЛОВИЯХ И ПРИ ШИРОТНЫХ ПЕРЕМЕЩЕНИЯХ 03.00.13 - Физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Ендропов О.В. Новосибирск 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ 3 Введение.….……………………………………………….…………….… Обзор литературы…………………………….……………. 9 Глава 1. Современные представления ...»

« Гегерь Эмилия Владимировна ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ТЕХНОГЕННЫХ НАГРУЗОК ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ФОРМИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Золотникова Галина Петровна Брянск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ Cписок используемых сокращений 5 Общая характеристика работы - 7 Глава 1 ...»

« КОЗЛОВА Александра Дмитриевна РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАРВОВИРУСА И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., профессор Обухов И.Л. Москва 2014 год ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС) 1.1 Клинические признаки ...»

« Головатских Инна Васильевна ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ НЕКОТОРЫМИ БИОЭЛЕМЕНТАМИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ И ЙОДА У ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ЮЖНОГО РЕГИОНА БАШКИРИИ (НА ПРИМЕРЕ Г.МЕЛЕУЗА И МЕЛЕУЗОВСКОГО РАЙОНА) 03.01.04 - Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Аглетдинов Эдуард Феликсович доктор медицинских наук Уфа – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ...»

« САМСОНОВА ИРИНА ДМИТРИЕВНА МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ СТЕПНОГО ПРИДОНЬЯ 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант – доктор биологических наук, профессор Добрынин Н.Д. Москва 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………. 5 1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕДОНОСНЫХ РЕСУРСОВ……………………………………………………………… 11 1.1 Оценка медоносных ресурсов и медосбора……………………… 11 1.2 Изучение медоносов семейства бобовые и ...»

« СТАРШОВ Алексей Александрович МИКРООРГАНИЗМЫ С ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИМИ И ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА, АЛЬТЕРНАТИВНОГО ФОСФОРНЫМ УДОБРЕНИЯМ И ХИМИЧЕСКИМ ФУНГИЦИДАМ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук Л.В. Коломбет, кандидат биологических наук И.А. Дунайцев Оболенск – 2013 2 ...»

« НГУЕН ДИНЬ ФУНГ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ РУССКОГО ОСЕТРА (ACIPENSER GUELDENSTAEDTII) В ВОЛГО-КАСПИЙСКОМ БАССЕЙНЕ МЕТОДОМ МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ Специальность: 03.02.06 - Ихтиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Распопов В.М. Астрахань – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Краткие сведения о биологии вида 1.2. Краткий обзор исследований русского ...»

« ТЕЛЯТНИКОВ Михаил Юрьевич ОСОБЕННОСТИ РАСНРЕДЕЛЕНИЯ ТУНДРОВОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ СИБИРСКОГО СЕКТОРА АРКТИКИ 03.00.05 - Ботаника! 03.00.1|б - Экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант д.б.н. проф. В.Н. Седельнико'р Новосибирск - 2005 2 Оглавление Введение 5 Глава 1. Природные условия 16 ** 1.1. Рельеф и геология Сибирской Арктики 16 1.2. Климат 18 # 1.2.1. Климат Сибирской Арктики 20 1.3. Криогенный микро- и мезорельеф 26 1.4. ...»




 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.