WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 14 |

Разработка пцр-тест-систем для идентификации парвовируса и генотипирования вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И

СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ»

РОССЕЛЬХОЗНАДЗОРА

МИНИСТЕРСТВА СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

КОЗЛОВА

Александра Дмитриевна

РАЗРАБОТКА ПЦР-ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ПАРВОВИРУСА И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., профессор Обухов И.Л.

Москва 2014 год

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС)

1.1 Клинические признаки

1.2 Пути передачи

1.3 Патогенез

1.4 Характеристика возбудителя

Классификация

Морфология и геном вируса

Устойчивость

Антигенная вариабельность

Патогенность

1.5 Диагностика ПВИС

2. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)

2.1 Клинические признаки

2.2 Пути передачи

2.3 Патогенез

2.4 Характеристика возбудителя

Классификация

Морфология и химический состав

Устойчивость

Организация генома РРСС

Генетическая вариабельность вируса РРСС

2.5 Диагностика РРСС

3. Заключение по обзору литературы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

4.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

4.2. Биологический материал, использованный в работе

4.3. Проведение ПЦР-анализа

Экстракция НК методом осаждения изопропанолом

4.3.1.

Экстракция НК наборами Qiagen

4.3.2.

Проведение ПЦР (ПВС) и ОТ-ПЦР (вирус РРСС)

4.3.3.

4.4. Клонирование ДНК и кДНК в плазмиду pGEM-t

Клонирование ДНК в фаг gt10

4.5.

4.6. Очистка продуктов ПЦР

4.7. Секвенирование

4.8. Проведение филогенетического анализа

Результаты исследований

5. Разработка тест-системы для выявления ДНК парвовируса свиней................. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции 5.1.

ДНК ПВС

Анализ специфичности работы олигонуклеотидов

5.2.

Подбор оптимальных условий амплификации

5.3.

Введение контрольных образцов

5.4.

Анализ чувствительности тест-системы

5.5.

6. Разработка тест-системы для выявления и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней

Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции РНК вируса РРСС

Анализ специфичности работы олигонуклеотидов

Подбор оптимальных условий амплификации

Введение контрольных образцов

Анализ чувствительности тест-системы

7. Выбор метода экстракции нуклеиновых кислот

Подбор условий экстракции НК из спермы с использованием метода осаждения изопропанолом

Использование наборов Qiagen

8. Исследование вакцин против РРСС

9. Исследование биологического материала от свиней

Обнаружение образцов, содержащих ДНК ПВС

Обнаружение образцов, содержащих РНК вируса РРСС

Расследование вспышек, вызванных вирусом РРСС

Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса РРСС

Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в 2009-2013гг

Анализ биологического материала на наличие смешанных инфекций............. Проведение комиссионных испытаний

Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления ДНК ПВС

Сравнение с набором реагентов №1 (производство Россия)

Сравнение с набором реагентов №2 (производство Россия)

Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления РНК вируса РРСС

Сравнение с наборами реагентов №1 и №2 (производство Россия)............... Сравнение с набором реагентов №3 (производство Россия)

Сравнение с набором реагентов №4 (производство Франция)

ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BHQ Black Hole Quencher FRT Fluorescent Real-Time LAMP loop-mediated isothermal amplification National Center for Biotechnology Information – Национальный NCBI центр биотехнологической информации open reading frame (открытая рамка считывания) ORF loop-mediated isothermal amplification с обратной ОТ-LAMP PAM porcine alveolar macrophages PBS phosphate buffer solution PPV porcine parvovirus PRSSV porcine reproductive and respiratory syndrome virus RFLP restriction fragment length polymorphism TaqF Thermus aquaticus ВКО внутренний контрольный образец ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат ИФА иммуноферментный анализ кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота К+ положительный контрольный образец К- отрицательный контрольный образец этапа амплификации коп/мл количество копий НК в мл КК культура клеток НК нуклеиновые кислоты н.п. нуклеотидных пар ОКО отрицательный контрольный образец этапа экстракции НК ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПВС парвовирус свиней ПВИС парвовирусная инфекция свиней ПЦР полимеразная цепная реакция РНК рибонуклеиновая кислота РРСС репродуктивно-респираторный синдром свиней РТГА реакция торможения гемагглютинации РГА реакция гемагглютинации ТЕ-буфер буфер на основе Триса и ЭДТА ЦПД цитопатическое действие

ВВЕДЕНИЕ



Парвовирус свиней (ПВС) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома (РРСС) являются вирусными этиологическими агентами репродуктивных патологий свиноматок, которые широко распространены в мире.

Так по данным Ковалишина В.Ф. среди импортируемого поголовья репродуктивная патология в 28% случаев вызвана вирусом РРСС (наиболее распространенный вирусный этиологический агент) и в 4% – парвовирусом, в случае респираторной патологии вирус РРСС является этиологическим агентом в 60% случаев и уступает по распространенности только цирковирусу 2 типа [3].

мумифицированных и нежизнеспособных поросят [12, 54, 55, 104]. Также возможно коинфицирование животного [1].

бессимптомного носительства. При этом животные-вирусоносители выделяют вирус в окружающую среду и являются источниками заражения заболеваний необходимо использование современных методов лабораторной диагностики.

Классическим методом диагностики вирусных болезней является выделение вируса на культуре клеток, однако, этот метод длительный, дорогостоящий и трудоемкий. В РФ широко применяются ИФА и РТГА для обнаружения специфических антител. Данные методы не позволяют дифференцировать поствакцинальные антитела от постинфекционных, выявлять вирусоносителей при обследовании вакцинированного поголовья и исследовать сперму. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющий выявлять вирусный геном даже при низкой вирусной нагрузке в любом биологическом материале.

Важной задачей является своевременное выявление ПВС, который может длительное время персистировать в стаде и проявляться только у супоросных свиноматок, не имеющих иммунитета к данному возбудителю.

Таким образом, разработка диагностикумов для выявления ПВС и вируса РРСС являются актуальными направлениям ветеринарной диагностики.

Целью данной работы являлась разработка тест-систем для выявления ДНК парвовируса свиней и генотипирования вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реальном времени».

следующие задачи:

1. Подобрать праймеры и зонды, оптимизировать условия ПЦР для рекомбинантные положительные контроли.

2. Определить аналитическую специфичность и чувствительность тестсистем.

3. Провести комиссионные испытания, утвердить нормативную документацию и внедрить в лабораторную практику тест-системы для выявления парвовируса свиней и генотипирования вируса РРСС.

4. Идентифицировать ПВС и провести филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ.

Сконструированы оригинальные праймеры и зонды для амплификации и детекции ДНК ПВС и генотипирования РРСС.

Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью – 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.

Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью – 103 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.

При проведении филогенетического анализа установлено, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов, отличаются от вакцинных штаммов и относятся к первому и второму субтипам европейского генотипа вируса.

последовательности вируса РРСС из свинокомплексов отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики данной болезни на территории нашей страны.

Практическая значимость работы.

Разработана нормативная документация по применению следующих тест-систем: 1) «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней; 2) «РРСС»

для выявления и генотипирования вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции.

ПЦР-тест-система «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в «реальном времени» внедрена в ветеринарную практику с 2010 года, тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС – с 2013 года. Рекламаций на данные тестсистемы не поступало.

При проведении сравнительного анализа ПЦР-наборов, применяемых на территории РФ, установлено, что разработанная тест-система «ПВС»

имеет в 100 раз большую чувствительность, чем тест-система №1 и в 10 раз, чем тест-система №2. Показано, что только тест-система «РРСС» в образцах из 16–ти неблагополучных свинокомплексов выявляла вирус РРСС в отличие от тест-систем №1, №2 и имела чувствительность в 10 раз выше, чем наборы реагентов №3 и №4 в 4-х пробах патматериала.

Основные положения, выносимые на защиту Разработанная тест-система для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени»

обладает 100% специфичностью и выявляет 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.



Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 14 |
 

Похожие материалы:

« Головатских Инна Васильевна ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ НЕКОТОРЫМИ БИОЭЛЕМЕНТАМИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ И ЙОДА У ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ЮЖНОГО РЕГИОНА БАШКИРИИ (НА ПРИМЕРЕ Г.МЕЛЕУЗА И МЕЛЕУЗОВСКОГО РАЙОНА) 03.01.04 - Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Аглетдинов Эдуард Феликсович доктор медицинских наук Уфа – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ...»

« САМСОНОВА ИРИНА ДМИТРИЕВНА МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ СТЕПНОГО ПРИДОНЬЯ 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант – доктор биологических наук, профессор Добрынин Н.Д. Москва 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………. 5 1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕДОНОСНЫХ РЕСУРСОВ……………………………………………………………… 11 1.1 Оценка медоносных ресурсов и медосбора……………………… 11 1.2 Изучение медоносов семейства бобовые и ...»

« СТАРШОВ Алексей Александрович МИКРООРГАНИЗМЫ С ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИМИ И ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА, АЛЬТЕРНАТИВНОГО ФОСФОРНЫМ УДОБРЕНИЯМ И ХИМИЧЕСКИМ ФУНГИЦИДАМ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук Л.В. Коломбет, кандидат биологических наук И.А. Дунайцев Оболенск – 2013 2 ...»

« НГУЕН ДИНЬ ФУНГ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ РУССКОГО ОСЕТРА (ACIPENSER GUELDENSTAEDTII) В ВОЛГО-КАСПИЙСКОМ БАССЕЙНЕ МЕТОДОМ МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ Специальность: 03.02.06 - Ихтиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Распопов В.М. Астрахань – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Краткие сведения о биологии вида 1.2. Краткий обзор исследований русского ...»

« ТЕЛЯТНИКОВ Михаил Юрьевич ОСОБЕННОСТИ РАСНРЕДЕЛЕНИЯ ТУНДРОВОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ СИБИРСКОГО СЕКТОРА АРКТИКИ 03.00.05 - Ботаника! 03.00.1|б - Экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант д.б.н. проф. В.Н. Седельнико'р Новосибирск - 2005 2 Оглавление Введение 5 Глава 1. Природные условия 16 ** 1.1. Рельеф и геология Сибирской Арктики 16 1.2. Климат 18 # 1.2.1. Климат Сибирской Арктики 20 1.3. Криогенный микро- и мезорельеф 26 1.4. ...»

« ХАМИДУЛЛИНА ГУЛЬНАРА ГИЗАРОВНА ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ НАСАЖДЕНИЙ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PINUS SYLVESTRIS L.) В РАЗЛИЧНЫХ ЛЕСОРАСТИТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ НА БУГУЛЬМИНСКО–БЕЛЕБЕЕВСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ (В ПРЕДЕЛАХ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН) Специальность 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2014 2 Содержание Введение ………………………………………………………………….3 3 Глава 1. Обзор литературы………………………………………….… 8 1.1 Защитные лесные насаждения и ...»

« Карбышев Михаил Сергеевич СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА КАЛИЕВОГО КАНАЛА KvAP И -ТЕРАФОТОКСИНА-Gr3a ПОЛУЧЕННЫХ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩИХ СИСТЕМАХ 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Чердынцева Н.В. доктор химических наук, профессор Дойч Ф. Новосибирск – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общая ...»

« ЧУДНОВСКАЯ ГАЛИНА ВАЛЕРЬЕВНА БИОЭКОЛОГИЯ И РЕСУРСЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ Специальность 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: Чхенкели Вера Александровна, доктор биологических наук, профессор Иркутск – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ Введение…………………………………………………………………………….4 Глава 1. Обзор литературы по состоянию проблемы исследований ресурсов лекарственных растений …………………………………….11 1.1 Развитие ...»

« Семёнов Михаил Александрович Экологические механизмы формирования экосистемного биоразнообразия при искусственном лесовосстановлении (на примере Цнинского лесного массива) Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени Кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н.Н. Харченко Воронеж – 2014 2 Оглавление Введение Глава 1. Обзор литературы по изучаемому вопросу 1.1 История изучения биологического ...»

« Афанасьев Евгений Анатольевич ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АДАПТАЦИИ И КОРРЕКЦИЯ ДЕЗАДАПТИВНЫХ СОСТОЯНИЙ У УЧАЩИХСЯ МЛАДШИХ КЛАССОВ 03.00.13- физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.Н. Васильев Томск- 2003 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………….…………….………5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общие представления об адаптации…………………….……….………. 9 1.2. Особенности физиологической адаптации ...»




 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.