WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |

Мультиплексные методы определения вирусиндуцированной экспрессии цитокинов на основе микрочипов и пцр

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВА

Марина Александровна

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСИНДУЦИРОВАННОЙ ЭКСПРЕССИИ ЦИТОКИНОВ НА ОСНОВЕ

МИКРОЧИПОВ И ПЦР

Специальность 03.02.02 – вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Васин Андрей Владимирович Санкт-Петербург –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления о цитокинах

1.1.1 Классификация и функции цитокинов

1.1.2 Цитокиновые рецепторы и общий механизм внутриклеточной передачи сигнала 1.2 Цитокины как медиаторы иммунного ответа

1.2.1 Цитокины и иммунный ответ при вирусных инфекциях

1.2.2 Роль цитокинов в иммунном ответе на инфекцию вирусом гриппа

1.3 Современные методы определения цитокинов

1.3.1 Особенности проведения анализа цитокинов

1.3.2 Методы выявления цитокинов

1.3.3 Технология микрочипов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты

2.1.1 Клеточные культуры

2.1.2 Вирусы

2.2 Вирусологические методы

2.2.1 Определение инфекционной активности вируса

2.2.2 Стимуляция клеток ВГА

2.3 Иммунологические методы

2.3.1 «Сэндвич»-ИФА

2.3.2 Мультиплексный «сэндвич»-вариант МФА в формате микрочипа

2.4 Молекулярно-генетические методы

2.4.1 Экстракция РНК

2.4.2 Обратная транскрипция

2.4.3 Полимеразная цепная реакция

2.4.4 Электрофорез

2.4.5 Печать олигонуклеотидного микрочипа

2.4.6 Подготовка пробы кДНК для гибридизации методом ОТ-ПЦР

2.4.7 Подготовка пробы амплифицированной мРНК для гибридизации методом ОТ-IVT.

2.4.8 Подготовка библиотек кДНК для гибридизации с использованием набора MINT.. 2.4.9 Гибридизация на олигонуклеотидном микрочипе

2.4.10 Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени

2.4.11 Детекция вирусной РНК методом ПЦР

2.5 Методы вычислительной биологии

2.5.1 Филогнетический анализ гена NS1 вируса гриппа типа А

2.5.2 Общие стратегии при конструировании олигонуклеотидных зондов и праймеров 2.5.3 Анализ изображения, получаемого после гибридизации

2.5.4 Анализ результатов мПЦР

2.5.5 Статистические методы анализа

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............. 3.1 Выбор штаммов вирусов гриппа А и клеточной модели для изучения особенностей экспресиии цитокинов

3.2 Разработка олигонуклеотидного микрочипа для выявления мРНК цитокинов и его применение для изучения роли белка NS1 вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) в индукии цитокиновго ответа

3.2.1 Подбор олигонуклеотидных зондов и праймеров для мРНК цитокинов-мишеней ILIL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-, TNF- человека

3.2.2 Создание лабораторного образца олигонуклеотидного микрочипа для анализа экспрессии цитокинов и выбор условий проведения основных этапов гибридизации........... 3.2.3 Выбор условий проведения основных этапов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе

3.2.4 Оценка аналитической чувствительности олигонуклеотидного микрочипа......... 3.2.5 Выбор способа подготовки флуоресцентно меченой пробы для анализа на микрочипе на примере клеток А549, инфицированных вирусом гриппа A/Kurgan/5/ (H5N1).

3.2.6 Анализ роли белка NS1 вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) в индукии цитокиновго ответа в клетках А549 методом олигонуклеотидного микрочипа и ОТ-ПЦР

3.3 Разработка метода определения уровня цитокинов с использованием мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

3.3.1 Подбор праймеров и TaqMan зондов и оптимизация условий проведения реакции мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, ILIL-12, IL-18, IFN-, TNF- человека

3.3.2 Проверка валидности системы мПЦР для оценки экспрессии цитокинов.............. 3.4 Сравнение паттернов экспрессии мРНК цитокинов в клетках A549, инфицированных вирусами гриппа A/H1N1pdm09, А/H3N2 и А/H5N1 методом мультиплексной ПЦР.................. 3.5 Разработка белкового микрочипа для количественного выявления цитокинов................. 3.5.1 Выбор моноклональных антител и рекомбинантных цитокинов для использования в микрочипе

3.5.2 Дизайн белкового биочипа для выявления IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN- и TNFчеловека.

3.5.3 Анализ специфичности и чувствительности белкового микрочипа с помощью рекомбинантных цитокинов

3.5.4 Анализ влияния гена NS1 вируса H5N1 на спектр цитоконов, секретируемых клетками МКПК методами биочипа и традиционного ИФА

3.6 Анализ особенностей экспрессии цитокинов клетками A549 на уровне транскрипции и на уровне трансляции при заражении вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09)............. Заключение

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Грипп – это острая респираторная вирусная инфекция, вызывающая сезонные эпидемии и периодические пандемии с высокой летальностью (ВОЗ, 2014). Для вирусов гриппа характерен высокий уровень вариабельности генома.

Вследствие отсутствия корректорской активности у вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы при репликации происходит постоянное накопление мутаций, которые обеспечивают приобретение устойчивости к противовирусным препаратам и ускользание от механизмов приобретенного иммунитета. Кроме того в процессе реассортации геномных сегментов в популяции человека могут появляться новые несвойственные ей штаммы вируса гриппа, обладающие пандемическим потенциалом. Примерами таких вирусов являются вирус «испанки» 1918 года и пандемический вирус H1N1pdm2009.

принадлежности могут существенно отличаться по своим генетическим характеристикам, обладать разной степенью патогенности и, следовательно, вызывать штамм-специфический иммунный ответ организма, одной из важнейших характеристик которого является цитокиновый статус. Цитокины – это ведущие физиологические медиаторы, вырабатываемые клетками в ответ на внешние воздействия и образующие сложную сеть взаимодействий, которые играют ключевую роль в развитии иммунного ответа и восстановлении гомеостаза (Симбирцев, 2002; Tarrant, 2010). В настоящее время показано, что вирусы гриппа типа А вызывают продукцию хемокинов (RANTES, MIP-1, MCPMCP-3 и IP-10), провоспалительных (IL-1, IL-6, IL-18 и TNF-) и антивирусных (IFN-, IFN-) цитокинов (Julkunen et al., 2001). Существуют общие закономерности в паттерне экспрессии цитокинов при гриппе, однако для разных штаммов вируса уровень цитокинов может сильно отличаться. Наиболее ярким примером «нестандартного» проявления цитокинового профиля является гиперцитокинемия, или «цитокиновый шторм», – неконтролируемая и не несущая защитной функции избыточная продукция цитокинов (Chan et al., 2005; Lee at al., 2009). Данное явление было хорошо изучено для высокопатогенных вирусов гриппа A/H5N1 человека, для которых характерна высокая степень летальности, во многом вызванная гиперцитокинемией.

Современная диагностика цитокинов требует наличия точных и чувствительных методов их измерения. Несмотря на большое число методик, разработанных для определения уровня цитокинов в клетках, тканях и биологических жидкостях, не все они удовлетворяют требованиям точности, чувствительности, воспроизводимости, доступности, простоты исполнения и низкой стоимости проведения анализа. Кроме того для характеристики цитокинового статуса наиболее целесообразным является одновременное измерение нескольких цитокинов в одном эксперименте. Это требование обусловлено присущими цитокинам плейотропностью, избыточностью действия и эффектом формирования цитокиновых каскадов (Wang et al., 2002; Huang et al., 2002; Tam et al., 2002).

Таким образом, разработка новых современных методов, позволяющих проводить высокопроизводительное мультиплексное определение цитокинового статуса при гриппе, является чрезвычайно актуальной задачей современной молекулярной вирусологии и медицины.

Цель исследования Разработка мультиплексных методов оценки профиля цитокинов в клетках человека, инфицированных вирусами гриппа А, на основе микрочипов и ПЦР.

Задачи исследования 1. Разработать системы для определения мРНК цитокинов IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN- и TNF- человека на основе олигонуклеотидного микрочипа и мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

2. Сравнить профили мРНК цитокинов в клетках A549 при заражении вирусами гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm2009), A/Victoria/361/ (H3N2) и A/chicken/Kurgan/5/05 (H5N1).

3. Разработать белковый микрочип для количественного определения цитокинов IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN- и TNF- человека.

4. Охарактеризовать с помощью разработанных методов изменения профиля цитокинов (мРНК и секретируемых белков) в клетках А549, A/California/07/09 (H1N1pdm2009).

Научная новизна работы В процессе выполнения исследования разработан не имеющий прямых аналогов количественный метод детекции мРНК цитокинов IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN- и TNF- человека с использованием мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Впервые в России были разработаны белковый микрочип для количественной детекции IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN- и TNFчеловека и олигонуклеотидный микрочип для оценки мРНК IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN- и TNF- человека. Все разработанные системы были успешно апробированы на биологическом материале, полученном при заражении клеток линии А549 различными штаммами вирусов гриппа А. Получен ряд интересных данных, дополняющих имеющиеся представления о штаммспецифическом вирус-индуцированном цитокиновом клеточном ответе.

Практическая значимость работы Выполненная работа представляет собой прикладное научное исследование.

Показана возможность применения разработанных методов для изучения экспрессии цитокинов, индуцированной вирусами гриппа. Измерение уровня цитокинов у пациентов при гриппе необходимо для своевременного прогнозирования течения и исхода заболевания, в том числе предупреждения развития потенциально летальной реакции гиперцитокинемии (Julkunen et al., 2001; van Reeth, 2000). Предложенные методы для определения цитокинового статуса могут быть также использованы при разработке и испытаниях противогриппозных вакцин с целью оценки их безопасности и эффективности при формировании специфического гуморального и клеточного иммунитета. Кроме того разработанные системы могут использованы для анализа экспрессии цитокинов не только при гриппе, но и при проведении других биологических и медицинских исследований, связанных с исследованием уровня цитокинов.

Лабораторные образцы микрочипов и системы мультиплексной ПЦР для оценки цитокинового профиля могут быть в дальнейшем использованы для внедрения в производство.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработан олигонуклеотидный микрочип для качественного выявления мРНК IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN- и TNF-.

Чувствительности предложенного метода и традиционного метода ОТПЦР являются сопоставимыми.



Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 17 |
 

Похожие материалы:

« Петренко Дмитрий Владимирович Влияние производства фосфорных удобрений на содержание стронция в ландшафтах Специальность 03.02.08 - экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Белюченко Иван Степанович Москва – 2014 г. Содержание Введение Глава 1.Состояние изученности вопроса и цель работы 1.1 Экологическая роль стронция в функционировании ландшафта . 7 1.1.1 Общая характеристика ...»

«Мальцева Елена Львовна Мембраны и ферменты как мишени действия модуляторов систем вторичных посредников 03.01.02 –биофизика Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2011 2 Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик РАН Островский Михаил Аркадьевич доктор биологических наук, член- корреспондент РАН Бачурин Сергей Олегович доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович Ведущая организация: Учреждение ...»

« Смирнов Сергей Николаевич ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ МОНИТОРИНГА ВИДОВОГО СОСТАВА ЧЛЕНИСТОНОГИХ В ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ ПИТОМНИКАХ НА СЕВЕРО-ЗАПАДЕ РОССИИ Специальность 03.02.05 — энтомология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Гричанов Игорь Яковлевич Санкт-Петербург – Пушкин 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ Стр. Введение 4 Глава 1. Аналитический обзор литературы 10 1.1. Питомниководство в России и ...»

« КОБОЗЕВА Елена Валерьевна ВИДОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ВИДОВ StY-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА ELYMUS L. АЗИАТСКОЙ РОССИИ 03.02.01 – “Ботаника” 03.02.07 – “Генетика” ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д.б.н., c.н.с. А.В. Агафонов, д.б.н., c.н.с. С.В. Овчинникова Новосибирск - 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...»

« ЛЮТЕНКО Игорь Владимирович СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКИ, ОЦЕНКИ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ТОНЗИЛЛИТА У ДЕТЕЙ НА ОСНОВЕ МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И БИОИНФОРМАЦИОННОГО АНАЛИЗА 03.01.09 – Математическая биология, биоинформатика (медицинские науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Шульга Леонид Васильевич Курск – 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………….…. 4 ...»

« Лукина Юлия Николаевна ПРОБЛЕМЫ ЗДОРОВЬЯ РЫБ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ЕВРОПЕЙСКО-СИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ ПАЛЕАРКТИКИ Специальности: 03.02.08 – экология 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, ХАРАКТЕРИСТИКА КАЧЕСТВА ВОД И АНТРОПОГЕННАЯ НАГРУЗКА НА ПРЕСНОВОДНЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ 1.1. Онежское озеро 1.2. Река Кара 1.3. Выгозерское ...»

« Кулаков Сергей Сергеевич Очаговое усыхание Pinus sylvstris на юге Красноярского края в результате воздействия корневых патогенов Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.08 – Экология Научный руководитель, доктор биологических наук, профессор И.Н. Павлов Красноярск 2014 1 СОДЕРЖАНИЕ Введение…………………………………………………………………… 4 1 Современное состояние вопроса……………………………………… 8 1.1 Глобальное изменение климата и его влияние на лесные 11 ...»

« ...»

«Карпеченко Никита Александрович АНАЛИЗ БЕЛКОВЫХ СПЕКТРОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПУТЕЙ И ИНВЕРТИРОВАНЫХ ПОВТОРОВ ДНК ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В ЛЕСОСТЕПИ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Попов В. Н. Воронеж – 2014 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………. 6 Глава 1. ОБЗОР ...»

« Горбач Вячеслав Васильевич ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ БУЛАВОУСЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA: HESPERIOIDEA et PAPILIONOIDEA) ВОСТОЧНОЙ ФЕННОСКАНДИИ 03.02.05 – энтомология 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: член-корреспондент РАН, профессор, доктор биологических наук Ивантер Эрнест Викторович Петрозаводск 2014 -2СОДЕРЖАНИЕ Введение 4 Глава 1. Природно-климатические условия района исследований 10 Географическое ...»




 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.