WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 |

Активные формы кислорода и их источники в программированной гибели клеток растений и цианобактерии аnabaena variabilis

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ШЕСТАК Анна Александровна

АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИХ ИСТОЧНИКИ В

ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И

ЦИАНОБАКТЕРИИ АNABAENA VARIABILIS

03.00.2503 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Самуилов Виталий Дмитриевич Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич Научно-исследовательский институт физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва доктор биологических наук, Доронин Юрий Константинович Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится «20» ноября 2007 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д. 501.001.52 при Московском государственном университете им.

М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.

М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «18 » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, Е.Н. Калистратова кандидат биологических наук Актуальность темы. Активные формы кислорода (АФК) в клетках растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, а также в пероксисомах, аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме. АФК обладают высокой окислительной способностью и скоростью взаимодействия. Они способны регулировать рост, развитие растений, участвовать в иммунитете, могут быть использованы клеткой при реализации ПКС. Источники, механизмы образования АФК и их участие в сигнальных системах являются главными направлениями в этой области исследований. В зависимости от концентрации АФК может происходить активация или ингибирование ферментов, задействованных в гибели клеток по типу некроза или апоптоза.

Цель работы – исследовать активные формы кислорода и их источники в программируемой гибели клеток в листьях гороха и клеток Аnabаena variabilis.

Задачи работы:

1. Испытать действие соединений, стимулирующих или подавляющих образование АФК, на ядра замыкающих клеток устьиц в эпидермисе листьев гороха и нуклеоиды клеток А. variabilis.

2. Исследовать действие хинакрина (ингибитора флавиновых ферментов) и ингибиторов фотосистемы II фотосинтетической элетронтранспортной цепи на образование АФК в клетках эпидермиса из листьев гороха.

3. Исследовать действие ингибитора гликолиза 2-дезоксиглюкозы, ингибиторов энергетического обмена митохондрий и разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования на образование АФК и их возможную роль в переходе с одного типа клеточной гибели к другому.

4. Исследовать действие ингибитора синтеза белка линкомицина на клетки А. variabilis.

_ Список сокращений и обозначений: БР – бенгальский розовый; БО – бромоксинил; ДГ – 2-дезоксиглюкоза; НСТ – нитросиний тетразолий; ПКС – программируемая клеточная смерть; УК – устьичные клетки; ФС – фотосистема; ХКФ – мхлоркарбонилцианидфенилгидразон; DCMU – 3-(3',4'-дихлорфенил)-1,1диметилмочевина, диурон; DAPI – 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид; DCF – 2,7-дихлорфлуоресцеин; DCFH-DA – 2,7-дихлорфлуоресцин диацетат; NAC – Nацетил-L-цистеин; PI – пропидий йодид; TMRE – этиловый эфир тетраметилродамина;

О2· – супероксидный анион-радикал; ·ОН – гидроксильный радикал; 1О2 – синглетный кислород.

Научная новизна работы. Испытано влияние соединений, вызывающих или подавляющих образование АФК на ПКС у растений и A. variabilis. Полученные результаты Предположительно Н2О2 активирует NADРH-оксидазу плазматической мембраны.

Установлено образование АФК пероксидазой клеточной стенки. Фотосенсибилизаторы БР и TMRE, подобно ингибиторам переноса электронов в ФСII диурону и бромоксинилу на свету, приводили к гибели клеток по типу некроза. Н2О2 вызывал увеличение содержания АФК в клетках, разрушение нуклеоидов и гибель клеток A. variabilis от антибиотика линкомицина, ингибитора синтеза белка у бактерий. Клетки A. variabilis погибали с признаками автолиза.

Установлена роль различных компартментов клетки (хлоропластов, митохондрий, плазматической мембраны, клеточного ядра и клеточной стенки) в образовании АФК и гибели УК.

Практическое значение работы. Полученные данные позволяют расширить представления о роли АФК и механизмах гибели клеток растений и бактерий. Испытан ряд гербицидов и цитотоксических агентов на образование АФК в клетках. Полученные результаты свидетельствуют о единстве путей ПКС у животных, растений, бактерий и могут быть использованы в клеточной биологии, микробиологии и биотехнологии в связи с работами в области сигнальных систем клеток, фитоиммунитета и лекарственной устойчивости микроорганизмов.



международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), всероссийской научной конференции «Молодые исследователи регионам» (Вологда, 2005), годичном собрании физиологов растений «Физиологические и молекулярногенетичекие аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (Москва, 2006), I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006), международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (Москва, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва 2006), XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), а также на заседаниях кафедры физиологии микроорганизмов МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 24 рисунками. Список литературы содержит библиографических названий.

Объекты и методы исследования. Исследования проводили на нижнем эпидермисе из листьев гороха (Pisum sativum L.) сорта Альфа и листьев кукурузы сахарной (Zea mays saccarata L.) сорта Монарх. Растения выращивали методом гидропоники при периодическом освещении (18 ч свет, 6 ч темнота) люминесцентной лампой (интенсивность света ~1000 лк, температура 20–25°С). В экспериментах использовали 8–15-суточные проростки. С помощью пинцета пленки эпидермиса отделяли и помещали в полистирольные культуральные планшеты и инкубировали в дистиллированной воде. Клетки цианобактерии A. variabilis АТСС 29413 (из коллекции кафедры физиологии микроорганизмов) культивировали в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, при постоянном освещении люминесцентными лампами (~1400 лк), на минеральной среде BG-11 (Rippka et al., 1979) в периодических условиях, при температуре ~27 °С. Перед посевом клеток среду стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 мин. В экспериментах использовали клетки из 3–5-суточных культур, находящихся в экспоненциальной фазе роста.

проникновения реагентов в клетки использовали метод вакуум-инфильтрации. Пленки эпидермиса инкубировали в растворе реагентов при 1,5–3 мм рт. ст. в течение 1–2 мин.

Инкубацию клеток проводили в темноте и на свету (~1000 лк) при 20–25°С.

Фиксация объекта, окрашивание и световая микроскопия. По завершении инкубации образцы обрабатывали 5 мин фиксатором Батталья (смесь хлороформа, 96%-ного этанола, ледяной уксусной кислоты и 40%-ного формалина в соотношении 5:5:1:1). Затем образцы отмывали 96%-ным этанолом 10 мин для удаления фиксатора, инкубировали 5 мин в воде и окрашивали красителем ядер гематоксилином Карацци в течение 20 мин.

Окрашенные пленки эпидермиса отмывали водопроводной водой и анализировали с помощью светового микроскопа Leitz Diaplan Wetzlar ФРГ. Из 300–500 просмотренных клеток определяли долю клеток с разрушенными ядрами (Самуилов и др., 2000).

Флуориметрия. Для регистрации АФК в клетках использовали DCFH-DA. Пленки эпидермиса помещали в 50 мкМ раствор DCFH-DA и инкубировали 10 мин в темноте. Этот краситель, проникая в клетку, дезацетилируется при участии внутриклеточных эстераз, превращаясь в нефлуоресцирующий DCFH. DCFH в клетках окисляется Н2О2 с участием флуоресцирующий DCF (LeBel et al., 1992). DCFH окисляется также ·ОН, СО3 ·, NO2·, но не О2· однако, вероятность окисления этими агентами в исследуемых клетках не велика (Wrona et al., 2005). Образцы отмывали 5 мин в темноте, закрепляли силиконом на прозрачную пластинку из полистирола и помещали в кювету под углом 45° к падающему лучу, содержащую буферный раствор 25 мМ HEPES-NaOH, pH 7,2, и 25 мМ КСI. Флуоресценцию DCF возбуждали светом с 485–495 нм и регистрировали при 515–525 нм. Для обработки данных, полученных с флуориметра (VersaFluor фирмы Bio-Rad, США), использовали компьютерные программы Read COM Port, Graph 2, Microsoft Excel.

Клетки A. variabilis дважды отмывали раствором 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7,2 и 25 мМ KCl центрифугированием при 3000 g 5 мин и суспендировали в том же растворе. Клетки центрифугированием и использовали в экспериментах в течение 2–4 ч после отмывки.

Клетки хранили в темноте при комнатной температуре. Величина D540 суспензии клеток составляла 0,6–0,9.

Флуоресцентная микроскопия. Для прижизненного исследования состояния клеток использовали флуоресцирующие красители. Для определения состояния ядер использовали 20 мкМ 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI окрашивание проводили мин), 0,2 мкМ пропидий йодид (PI окрашивание проводили 20 мин), 20 мкМ DCF-DA ( мин). Клетки A. variabilis окрашивали 20 мкМ DAPI в течение 1 ч и 20 мкМ DCF-DA в течение 20 мин в темноте, 2 мкМ PI в течение 1 ч. Наблюдения проводили на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M LSM510 (Германия). Для получения фотоснимков использовали встроенную цифровую видеокамеру и компьютерную программу AxiVision.

Конфокальная микроскопия. Изучение серийных оптических срезов объектов проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200M (Германия), оборудованного конфокальной сканирующей приставкой Zeiss LSM510Meta. Определение энергетического состояния митохондрий в УК эпидермиса из листа гороха проводили с помощью TMRE.

ТМRE является катионом, проникающим через мембраны. Внутриклеточные митохондрии генерируют мембранный потенциал со знаком «минус» внутри. Накопление проникающего катиона ТМRE в митохондриях напрямую свидетельствует об энергизации митохондрий.



Pages:     || 2 | 3 |
 


Похожие материалы:

«ШАМГУНОВА Регина Раисовна ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПТИЛИЙ СРЕДНЕЙ И СЕВЕРНОЙ ТАЙГИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.08 — экология 03.02.04 — зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург — 2010 Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com) Работа выполнена в ГОУ ВПО Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа – Югры доктор биологических наук, профессор ...»

«ШАДРИНА МАРИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 03.01.07 – Молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН доктор биологических наук, профессор Научный консультант: Петр Андреевич Сломинский Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН ...»

«Семенова Ольга Владимировна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА НАСЕЛЕНИЯ ЖУЖЕЛИЦ ПАРКОВОЙ ЗОНЫ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА НА ПРИМЕРЕ НИЖНЕГО ТАГИЛА 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург - 2008 2 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской Академии Наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Ольшванг Владимир Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук ...»

« Салеем Кайд Мохаммед Абдулла ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.00.16 –экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук 2 МОСКВА 2003 г. Работа выполнена в Российском государственеом университете нефти и газа им. И. М. Губкина на кафедре промышленной экологии. Научный ...»

«РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОКРОВ СТЕПЕЙ ЛЕВОБЕРЕЖЬЯ ДНЕСТРА: АНАЛИЗ ФЛОРЫ И КЛАССИФИКАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ Специальность 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Тирасполь 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии естественно-географического факультета ПГУ имени Т.Г. Шевченко Научные доктор сельскохозяйственных наук, руководители – профессор Валерий Федорович Хлебников, кандидат биологических наук Павел Яковлевич Пынзару Официальные ...»

«Рыжакова Ольга Сергеевна ИНТЕРСТИЦИАЛЬНАЯ КОЛЛАГЕНАЗА (ММП-1) И ЕЁ ЭНДОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ГЕНОМ Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ТИПА (HPV16) 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, ...»

« РИЗАЕВА Елена Петровна БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ - 1998 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета. Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Евтюгин Г.А. Научный консультант доктор химических наук, профессор Латыпова В.З. Официальные оппоненты: доктор ...»

«Гусев Евгений Сергеевич ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ФИТОПЛАНКТОНА СТРАТИФИЦИРОВАННЫХ ОЗЕР КАРСТОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ (ВЛАДИМИРСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.18 –гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Борок – 2007 Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Корнева Людмила Генриховна Официальные оппоненты: доктор ...»

«ЖЕРДЕВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ОЦЕНКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ЭКОТОКСИЧНОСТИ ПЕСТИЦИДОВ ПО DAPHNIA MAGNA STRAUS 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена в отделе рыбохозяйственной токсикологи Азовского научноисследовательского института рыбного хозяйства (ФГУП “АзНИИРХ”) Научный руководитель: доктор биологических наук Кренева Софья Викторовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук Бакаева ...»




 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.