WWW.DIS.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

Регуляция экспрессии гена аполипопротеина a-i человека при действии фактора некроза опухоли альфа

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МОГИЛЕНКО

Денис Александрович

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

АПОЛИПОПРОТЕИНА A-I ЧЕЛОВЕКА

ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА

03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010 г.

Работа выполнена в Отделе биохимии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков доктор биологических наук, Ирина Владимировна Гужова Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита состоится «28» октября 2010 года в 1300 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский проспект, дом 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, улица Академика Павлова, дом 12.

Автореферат разослан «_» сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Пучкова Л. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В фундаментальных медико-биохимических исследованиях было установлено, что высокий уровень аполипопротеина А-I (ApoA-I) в плазме крови коррелирует с низким риском развития атеросклероза и ишемической болезни сердца. ApoA-I человека входит в состав липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), участвует в обратном транспорте холестерола из периферических тканей в печень, обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами и, по-видимому, может выступать в роли сигнальной молекулы. Известно, что главными местами экспрессии гена apoA-I и синтеза белка ApoA-I у человека являются гепатоциты печени и энтероциты тощей кишки. Экспрессия гена apoA-I обнаружена также в плаценте, сердце, хрящевой ткани и в клетках желточного мешка зародышей млекопитающих. Вместе с тем, регуляция экспрессии гена apoA-I в клетках, отличных от энтероцитов и гепатоцитов, недостаточно охарактеризована.

В настоящее время все больше внимания вызывает представление об атеросклерозе как о процессе хронического воспаления (Hansson and Libby, 2006). Одним из ключевых факторов, участвующих в процессе воспаления при развитии атеросклеротических повреждений сосудов, является фактор некроза опухоли альфа (TNF) (Canault et al., 2008). TNF угнетает транскрипцию и снижают секрецию apoA-I в гепатоцитах человека (Song et al., 1998; Haas et al., 2003), а также приводит к уменьшению как содержания ApoA-I в составе ЛПВП, так и уровня ЛПВП в плазме крови (Khovidhunkit et al., 2004; Esteve et al., 2005).Тем не менее, молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена apoA-I при действии провоспалительных цитокинов все еще недостаточно изучены. Интересным и важным является изучение регуляции экспрессии гена apoA-I при действии провоспалительных цитокинов, таких как TNF, в гепатоцитах и клетках моноцитарно-макрофагального ряда.

Цели работы. Целью диссертационной работы является изучение тканеспецифической регуляции экспрессии гена apoA-I человека при действии TNF в клетках HepG2 и THP-1, а также выяснение роли сигнальных путей JNK, p38, MEK1/2, NFB и ядерных рецепторов HNF4, PPAR, PPAR и LXRs в этом процессе.

Задачи исследования.

1. Изучить регуляцию экспрессии гена apoA-I в клетках гепатомы человека HepG2 при действии TNF.

2. Исследовать возможность экспрессии гена apoA-I в клетках моноцитарно-макрофагального ряда человека THP-1 и её регуляции 3. Изучить роль сигнальных путей JNK, p38, MEK1/2 и NFB, а также ядерных рецепторов HNF4, PPAR, PPAR и LXRs в регуляции экспрессии гена apoA-I в клетках HepG2 и THP-1.

Научная новизна полученных результатов. Впервые показано участие ядерного рецептора PPAR в регуляции экспрессии гена apoA-I в клетках гепатомы человека (HepG2). Установлена роль ядерных рецепторов HNF4, PPAR, PPAR и LXRs в TNF-зависимом подавлении экспрессии гена apoA-I в клетках HepG2.

Впервые показано, что ген apoA-I экспрессируется в культивируемых человеческих клетках моноцитарно-макрофагального ряда – THP-1, в моноцитах и макрофагах, полученных из периферической крови человека, в перитониальных макрофагах мыши, причём экспрессия этого гена стимулируется при добавлении к клеткам провоспалительного цитокина TNF.

Показано участие сигнальных путей JNK, p38, MEK1/2, NFB и ядерных рецепторов PPAR и LXRs в TNF-зависимой стимуляции экспрессии гена apoA-I в клетках THP-1.

Практическое значение результатов исследования. Полученные результаты расширяют наши представления о тканеспецифической регуляции экспрессии гена apoA-I, а также указывают на механизмы регуляции экспрессии этого гена при действии на клетки провоспалительного цитокина TNF. Предложена гипотеза о противовоспалительной роли эндогенно-синтезированного ApoA-I в клетках моноцитарно-макрофагального ряда.



Результаты, полученные в этой работе, дополняют представления о роли TNF и ApoA-I в развитии нарушений липидного обмена и могут быть использованы при разработке методов тканеспецифической регуляции экспрессии гена apoA-I с целью терапии атеросклероза.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Показана роль сигнальных путей JNK, p38, MEK1/2 и NFB в угнетении экспрессии гена apoA-I в клетках HepG2 при действии • Показана экспрессия гена apoA-I в клетках моноцитарномакрофагального ряда THP-1 и установлена TNF-зависимая активация транскрипции этого гена.

• Установлено, что сигнальные пути JNK, p38, MEK1/2 и NFB принимают участие в активации экспрессии гена apoA-I в клетках THPпри действии TNF.

• Выяснено участие ядерных рецепторов HNF4, PPAR, PPAR и LXRs в TNF-зависимом подавлении экспрессии гена apoA-I в клетках HepG2, а также установлено, что PPAR и LXRs участвуют в активации транскрипции гена apoA-I в клетках THP-1 при действии Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих конференциях:16-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 28 мая – 1 июня, 2007 г., Санкт-Петербург, Россия;

17-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 26 – 30 мая, 2008 г., Санкт-Петербург, Россия; XIII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 8-11 июня 2009 г., СанктПетербург, Россия; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009», 13-18 апреля, 2009 г., Москва, Россия; 34th FEBS Congress, 4-9 июля, 2009 г., Prague, Czech Republic; International Conference “Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine”, 9-10 November 2009, St. Petersburg, Russia.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ.

Личный вклад автора в проведении исследования. Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях. Выделение РНК и клеточных белков, реакции обратной транскрипции и Real Time RT-PCR, иммунопреципитация хроматина, иммуноцитохимия, Вестерн-блоттинг, конструирование генетических конструкций, люциферазный тест и выделение ядерных белков выполнены соискателем. Культивирование клеточных линий HepG2 и THP- выполнено совместно с к.б.н. Э.Б. Диже и А.С. Трулевым. Эксперименты по проточной цитофлуорометрии выполнены совместно с к.б.н. И.В.

Кудрявцевым. Задержка белков в геле выполнена совместно с к.б.н. С.В.

Орловым.

Внедрение результатов работы. Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процесс Отдела биохимии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Россия, 197376, ул. Ак. Павлова, 12), Кафедры эмбриологии и Кафедры цитологии и гистологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета (Россия, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9).

Cтруктура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 271 наименование, из них источника на русском языке и 268 наименований на английском языке.

Диссертация изложена на 106 страницах. Результаты представлены в таблице и иллюстрированы 24 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Ингибиторы MAP-киназ были получены из «Biomol» SB203580 (ингибитор p38 MAP); SP600125 (ингибитор JNK1/2/3); U0126 (ингибитор MEK1/2) и ингибитор NFB (QNZ). Ингибитор Src-киназы PP2 был получен из «Biomol». Синтетические лиганды PPAR были получены из «Sigma»: WY-14643 (агонист) и MK886 (антагонист).

Синтетический агонист LXRs (TO901317) был получен из «Biomol». Синтетический агонист PPAR (GW1929) и синтетический антагонист PPAR (GW9662) были получены из “Sigma”. Рекомбинантный TNF человека был получен из “Sigma”. В данной работе использовались следующие антитела: мышиные моноклональные антитела против актина человека (“Abcam”, ab3280), мышиные моноклональные антитела против ApoA-I человека (“AbD Serotec”, 0650-0050), кроличьи поликлональные антитела против HNF человека (“Santa Cruz Biotechnology”, sc-8987), кроличьи поликлональные антитела против PPAR человека (“Santa Cruz Biotechnology”, sc-7196), кроличьи поликлональные антитела против LXR человека (“Abcam”, ab56237), мышиные моноклональные антитела против PPAR человека (“Abcam”, ab2779), козьи антитела против IgG мыши (FITC) (“Abcam”, ab6669-1), козьи антитела против IgG мыши (HRP) и козьи антитела против IgG кролика (HRP) (“Sigma”). pCMVL представляет собой вектор экспрессии бактериального генарепортера lacZ под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), и был получен ранее (Perevozchikov et al., 1997). pCMVHNF4, вектор экспрессии транскрипционного фактора человека HNF4, был любезно предоставлен Dr. Fukamizu (University of Tsukuba, Japan). pCMVHNF4D, вектор экспрессии доминантно-негативного мутанта транскрипционного фактора человека HNF4, был любезно предоставлен Dr. Leff (Wayne State University School of Medicine, USA). pAPOA-I(-2498/+173)-Luc, pAPOA-I(Luc, pAPOA-I(-256/+173)-Luc и pAPOA-I(-256/+72)-Luc, плазмиды, содержащие ген-репортер люциферазы светлячка под контролем делеционных вариантов 5’регуляторного участка гена apoA-I человека (-2498…+173), (-2498…+72), (-256…+173) и (-256…+72) относительно точки инициации транскрипции (+1) соответственно, были сконструированы с использованием методов генетической инженерии и описаны ранее (Лапиков и др., 2008).

Экспериментальная часть.



Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |
 

Похожие материалы:

«Зотов Александр Александрович ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДОЛГОНОСИКОВ ПОДСЕМЕЙСТВА LIXINAE (COLEOPTERA, CURCULIONIDAE): ЭКОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в отделе аридной экологии ФГБУН Институт аридных зон Южного научного Центра РАН доктор биологических наук, Научный руководитель: Арзанов Юрий Генрихович Замотайлов Александр Сергеевич, Официальные ...»

«Кляйн Ольга Ивановна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ С ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Научные ...»

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина. Научный ...»

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом саду ТГУ кандидат ...»




 
© 2013 www.dis.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.